Preparación de tejidos: métodos y técnicas
Los procedimientos de preparación de los tejidos para el examen microscópico son numerosos.
A continuación se exponen los métodos y técnicas más corrientes a saber, aislamiento de la muestra, fijación (esta técnica incluye tres estadios) y, por último, la deshidratación o corte.
Aislamiento de la muestra
El tejido a analizar se debe tomar rápidamente en cuanto muera el individuo o, si proviene de una zona del cuerpo extirpada quirúrgicamente, inmediatamente de finalizada la operación. La urgencia se debe a que las células, después de la muerte, se alteran, produciéndose una descomposición que modifica su aspecto. Esas alteraciones, denominadas degeneraciones pos-mortem, son variables, de unas células a otras y están en función de la temperatura. A menor temperatura mejor es la conservación.
Fijación
La técnica incluye tres estadios:
a) definir los componentes de los tejidos de forma que no se puedan producir ulteriores alteraciones pos-mortem;
b) facilitar que el tejido pueda ser cortado en láminas muy finas con mayor facilidad;
c) destruir los microorganismos patógenos. Los tejidos pueden fijarse por ebullición, pero casi siempre se recurre al empleo de soluciones químicas que penetran en su interior y coagulan los componentes; la solución más empleada es el formaldehído al 4 %.
Deshidratación y corte
Como los tejidos del cuerpo humano contienen gran cantidad de agua, al realizar la preparación hay una fase en que la muestra ha de ser impregnada con parafina, sustancia insoluble en el agua. Para que esta operación pueda realizarse, después de la fijación la muestra de tejido se introduce en una solución débil de alcohol, y posteriormente en soluciones cada vez más fuertes, hasta llegar al alcohol puro con la sustitución total del agua.
Superada la deshidratación, sería difícil impregnar el tejido con parafina, pues esta sustancia no es soluble en alcohol. Para ello existen algunos elementos conocidos como diafanízadores (xileno, tolueno, cloroformo y aceite de cedro), que son solubles tanto en alcohol como en parafina fundida. Posteriormente, la muestra de tejido se extrae del alcohol y se introduce en un agente diafanizante para que éste sustituya al alcohol.
El tejido se coloca después en un recipiente con parafina, dentro de un calentador, a temperatura suficiente para mantener líquida la propia parafina, y en procesos sucesivos, siempre en caliente, la primera parafina utilizada se sustituye dos veces por otra nueva.
La parafina, entonces, habrá penetrado en el tejido reemplazando al agente diafanizante. La facilidad con que pueden cortarse láminas muy finas de cera es la razón de incluir los tejidos en parafina. Para el uso microscópico las láminas de tejido deben ser muy delgadas, generalmente de 3-20 micras, y se cortan utilizando el micrótomo, aparato provisto de una hoja rotativa o deslizante.
Una vez cortadas, las láminas se disponen sobre un portaobjetos (pequeño cristal transparente rectangular), y para evitar la formación de pliegues que dificulten la visión del preparado, éste se calienta moderadamente.
Coloración y montaje
Antes de realizar esta fase, la sección de tejido preparada es semejante a un negativo fotográfico no revelado. Los constituyentes de los tejidos pueden clasificarse en basófilos y acidófilos, según que presenten afinidad por los colorantes básicos o ácidos.
La mayor parte de los cortes histológicos se tiñen con un colorante básico o con un ácido (los colorantes más usados son la matoxilina y la eosina: la primera tiñe las estructuras basófilas en azul o en púrpura violeta, y la segunda actúa sobre los componentes acidófilos, proporcionándoles coloración rosada o roja).
Esta última fase es la manipulación final a que se somete la preparación antes de pasar a la observación directa. Para realizarla, se extrae el agua residual de la sección mediante la serie alcoholxileno; después se rocía la sección con una gota de líquido de montaje (en general bálsamo del Canadá), y finalmente se recubre la sección con un cristal muy fino o cubreobjetos.